83 зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата описывается уравнением

27. Кинетика ферментативных реакций. Регуляция активности ферментов

Кинетика ферментативных реакций. Кинетика изучает скорости, механизмы реакций и влияние на них таких факторов, как концентрации ферментов и субстратов, темпера­тура, рН среды, присутствие ингибиторов или активаторов.

При постоянной концентрации субстрата скорость реакции прямо пропорциональна концентрации фермента. График зависимости скорости ферментативной реакции от кон­центрации субстрата имеет вид равнобочной гиперболы.

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента (а) и субстрата (б)

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса — Ментен:

где V — стационарная скорость биохимической реакции; Vmax — максимальная скорость; Кm — константа Михаэлиса; [S] — концен­трация субстрата.

Если концентрация субстрата низкая, т. е. [S]

Тогда

Таким образом, при низких концентраци­ях субстрата скорость реакции прямо пропор­циональна концентрации субстрата и описы­вается уравнением первого порядка. Это со­ответствует начальному прямолинейному уча­стку кривой V = f[S] (рисунок б).

При высоких концентрациях субстрата [S] >> Кm, когда Кm можно пренебречь, уравнение Михаэлиса — Ментен приобретает вид, т.е. V=Vmax.

Таким образом, при высоких концентрациях субстрата скорость реакции стано­вится максимальной и описывается уравнением нулевого порядка. Это соответствует участку кривой V =f [S], параллельному оси абсцисс.

При концентрациях субстрата, численно сравнимых с констан­той Михаэлиса, скорость реакции возрастает постепенно. Это вполне согласуется с представлениями о механизме ферментативной реак­ции:

где S — субстрат; Е — фермент; ES — фермент-субстратный комп­лекс; Р — продукт; k1 — константа скорости образования фермент-субстратного комплекса; k2 — константа скорости распада фермент-субстратного комплекса с образованием исходных реагентов; k3 — константа скорости распада фермент-субстратного комплекса с обра­зованием продукта.

Скорость превращения субстрата с образованием продукта (Р) про­порциональна концентрации фермент-субстратного комплекса [ES]. При малых концентрациях субстрата в растворе имеется некоторое число свободных молекул фермента (Е), не связанных в комплекс (ES). Поэтому при увеличении концентрации субстрата концентрация ком­плексов растет, следовательно, растет и скорость образования продук­та. При больших концентрациях субстрата все молекулы фермента связаны в комплекс ES (явление насыщения фермента), поэтому даль­нейшее повышение концентрации субстрата практически не увеличи­вает концентрацию комплексов и скорость образования продукта остается постоянной.

Таким образом, становится ясен физический смысл максимальной скорости ферментативной реакции. Vmах — это скорость, с которой реагирует фермент, полностью существующий в виде фермент-суб­стратного комплекса.

Константа Михаэлиса численно соответствует такой концентра­ции субстрата, при которой стационарная скорость равна половине максимальной. Данная константа характеризует кон­станту диссоциации фермент-субстратного комплекса:

Физический смысл константы Михаэлиса в том, что она характе­ризует сродство фермента к субстрату. Кm имеет малые значения, когда k1 > (k2 + k3), т.е. процесс образования комплекса ES преоб­ладает над процессами диссоциации ES. Следовательно, чем меньше значения Кm, тем сродство фермента к субстрату больше. И, наобо­рот, если Кm имеет большое значение, то (k2 + k3) > k1 и процессы диссоциации ES преобладают. В этом случае сродство фермента к субстрату небольшое.

Ингибиторы и активаторы ферментов. Ингибиторами ферментов называются вещества, снижающие активность ферментов. Любые денатурирующие агенты (например, соли тяжелых металлов, кислоты) являются неспецифическими ингибито­рами ферментов.

Обратимые ингибиторы — это соединения, которые нековалентно взаимодействуют с ферментом. Необратимые ингибиторы — это соединения, специфически связывающие функциональные группы активного центра и образующие ковалентные связи с ферментом.

Обратимое ингибирование разделяют на конкурентное и неконку­рентное. Конкурентное ингибирование предполагает структурное сход­ство ингибитора и субстрата. Ингибитор занимает место в активном центре фермента, и значительное количество молекул фермента ока­зывается блокировано. Конкурентное ингибирование можно снять, если повысить концентрацию субстрата. В этом случае субстрат вы­тесняет конкурентный ингибитор из активного центра.

Обратимое ингибирование может быть неконкурентным в отноше­нии субстрата. В этом случае ингибитор не конкурирует за место присоединения к ферменту. Субстрат и ингибитор связываются с раз­ными центрами, поэтому появляется возможность образования комп­лекса IE, а также и тройного комплекса IES, который может распа­даться с освобождением продукта, но с меньшей скоростью, чем комп­лекс ES.

По характеру своего действия ингибиторы подразделяются на:

Специфические ингибиторы оказывают свое действие на фермент, присоединяясь ковалентной связью в активном центре фермента и выключая его из сферы действия.

Неспецифическое ингибирование предполагает воздействие на фер­мент денатурирующих агентов (солей тяжелых металлов, мочевины и др.). В этом случае в результате разрушения четвертичной и третич­ной структуры белка происходит потеря биологической активности фермента.

Активаторы ферментов — это вещества, увеличивающие скорость фермен­тативной реакции. Чаще всего в качестве активаторов выступают ионы метал­лов (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, Mn2+, Mg2+ и т.д.). Различают металлы, находящиеся в составе металлоферментов, являющиеся кофакторами, и вы­ступающие в качестве активаторов ферментов. Кофакторы могут прочно связы­ваться с белковой частью фермента, что же касается активаторов, то они легко отделяются от апофермента. Такие металлы являются обязательными участника­ми каталитического акта, определяющими активность фермента. Активаторы уси­ливают каталитическое действие, но их отсутствие не препятствует протека­нию ферментативной реакции. Как правило, металл-кофактор взаимодейству­ет с отрицательно заряженными группировками субстрата. Металл с переменной валентностью принимает участие в обмене электронов между субстратом и ферментом. Кроме того, они принимают участие в образовании ста­бильной переходной конформации фермента, что способствует более быстро­му образованию ES комплекса.

Регуляция активности ферментов. Одним из основных механизмов регуляции метаболизма служит регуляция активности ферментов. Одним из примеров является аллостерическая регуляция, регуляция посредством активаторов и ингибиторов. Часто бывает так, что конечный продукт метаболического пути является ингибитором регуляторного фермента. Такой тип ингибирования называется ретроингибированием, или ингибированием по принципу отрицательной обратной связи.

Многие ферменты вырабатываются в виде неактивных предше­ственников-проферментов, а затем в нужный момент активируются за счет частичного протеолиза. Частичный протеолиз — отщепление части молекулы, которое приводит к изменению третичной структуры белка и формированию активного центра фермента.

Некоторые ферменты-олигомеры могут изменять свою активность за счет ассоциации — диссоциации субъединиц, входящих в их со­став.

Многие ферменты могут находиться в двух формах: в виде про­стого белка и в виде фосфопротеида. Переход из одной формы в дру­гую сопровождается изменением каталитической активности.

Скорость ферментативной реакции зависит от количества фермента, которое в клетке определяется соотношением скоростей его синтеза и распада. Этот способ регуляции скорости ферментативной реакции является более медленным процессом, чем регуляция активности фер­мента.

ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ СУБСТРАТА, СРЕДЫ И ТЕМПЕРАТУРЫ. УРАВНЕНИЕ МИХАЭЛИСА-МЕНТЕН И ЕГО ПАРАМЕТРЫ

Общие принципы кинетики химических реакций применимы и к ферментативным реакциям. На основании большого числа экспериментальных исследований было установлено, что зависимость скорости ферментативного процесса от концентрации субстрата в общем виде можно представить кривой, изображенной на рис. 5.5.

Рис. 5.5. Общий вид зависимости стационарной скорости протекания ферментативной реакции (vCT) от концентрации субстрата ([S]) при постоянной концентрации фермента:

а — реакция первого порядка (при [S] v ct

v max и скорость реакции не зависит от концентрации субстрата

При низкой концентрации субстрата зависимость стационарной скорости реакции от концентрации субстрата (см. рис. 5.5, участок а) близка к линейной и подчиняется кинетике реакций первого порядка, т. е. скорость реакции S —* Р прямо пропорциональна концентрации субстрата S и в любой момент времени t определяется следующим кинетическим уравнением: где [S] — молярная концентрация субстрата S; — d[S]/d/ — скорость убыли субстрата; кконстанта скорости реакции, которая в данном случае имеет размерность, обратную единице времени. При высокой концентрации субстрата (участок в) скорость реакции максимальна, постоянна и не зависит от концентрации субстрата [S]. В этих условиях реакция подчиняется кинетике реакций нулевого порядка v = к» и целиком определяется концентрацией фермента.

В данном случае проявляется важная особенность ферментативных реакций — явление насыщения фермента субстратом. На участке б скорость реакции пропорциональна произведению концентраций двух реагирующих веществ (субстрата и фермента), т. е. реакция протекает по законам реакции второго порядка. Из приведенной на рис. 5.5 зависимости видно, что изменение концентрации субстрата в области низких значений существенно влияет на скорость процесса, а при высоких концентрациях субстрата это влияние очень мало или практически отсутствует. При низких концентрациях субстрата скорость реакции контролируется двумя факторами: собственно скоростью катализируемой ферментом реакции и частотой столкновения фермента с субстратом. По мере увеличения концентрации субстрата частота столкновений перестает быть фактором, определяющим скорость реакции.

Уравнения кинетики последовательных реакций (5.5), (5.8), (5.9) справедливы и для кинетики ферментативных реакций, тщательное изучение которых показало, что общий вид кинетических кривых расходования субстрата S имеет 5-образный вид, типичный для реакций последовательного превращения (рис. 5.6).

Рис. 5.6. Общий вид кинетической кривой расходования субстрата S:

I — начальный участок (период индукции), который длится менее долей секунды и занимает незначительную часть общего времени протекания реакции. Здесь скорость меняется от нулевой до vCT; II — стационарный участок. На этом участке скорость остается примерно постоянной в течение нескольких минут; III — основной участок, на который приходится большая часть времени протекания реакции; здесь скорость монотонно падает

Такой вид кривой расходования субстрата по модели, предложенной Михаэлисом и Ментен, объясняется образованием промежуточного комплекса в ферментативном процессе: в ходе ферментативной реакции субстрат S образует с молекулой фермента Е соединение — фермент-субстратный комплекс ES, распадающийся по двум направлениям. При распаде по первому пути вновь образуется исходная молекула субстрата S и фермента Е. При распаде по другому пути образуется молекула продукта Р и регенерируется молекула фермента. Таким образом, механизм ферментативного процесса (ферментативного катализа) описывается как последовательная реакция фермент + субстрат фермент-субстратный комплекс —» продукт + фермент, в которой фермент Е связывается с субстратом S в обратимой реакции (константы скоростей к, к2) с образованием фермент-субстратного комплекса ES. Последний распадается в реакции с константой скорости Аз на фермент Е и продукт Р:

Экспериментальные доказательства рассмотренного механизма действия ферментов впервые получили Л. Михаэлис и М. Ментен (1913), принявшие, что промежуточный фермент-субстратный комплекс ES обратимо образуется согласно закону действия масс:

Они полагали, что скорость распада ES с образованием продукта Р мала по сравнению со скоростью установления равновесия, определяемого к и к2. На основании данных предположений было выведено уравнение, названное в честь авторов уравнением Михаэлиса-Ментен, выражающее количественное соотношение между концентрацией субстрата и стационарной скоростью ферментативной реакции:

где vmax — максимальная скорость реакции при больших концентрациях субстрата (см. рис. 5.6), а Кмконстанта Михаэлиса, представляющая собой константу диссоциации фермент-субстратного комплекса на фермент и исходный субстрат. . В

модели предполагается, что продукт не может обратно превращаться в субстрат (что справедливо для ранних стадий реакции, когда концентрация продукта низкая). Поскольку на начальной стадии реакции концентрация Р мала, то и вероятность обратной реакции продукта с ферментом бесконечно мала, и тогда к> определяет скорость всего процесса. В этом случае скорость ферментативной реакции vCT определяется как ,

что и подтверждает наличие прямолинейного начального участка на рис. 5.6.

В дальнейшем данная модель была развита с учетом того, что концентрация фермент-субстратного комплекса ES может уменьшаться с заметной скоростью.

В уравнении Михаэлиса-Ментен (5.12) величины vmax, Км постоянны для данного фермента, хотя могут меняться независимо друг от друга при различных условиях.

и реакция подчиняется уравнению первого порядка.

Это означает, что реакция не зависит от концентрации субстрата и протекает по уравнению нулевого порядка.

При Км = [S] , гст = Vmax/2, т. е. Км численно равна концентрации субстрата [S], при которой скорость реакции составляет половину максимальной величины. Это равенство может использоваться для определения константы Михаэлиса-Ментен.

Уравнение Михаэлиса-Ментен (5.12) можно преобразовать аналогично преобразованиям Гендерсона-Гассельбаха для диссоциации слабых электролитов:

или

Когда

Рис. 5.7. Кинетическая кривая ферментативной реакции

На рис. 5.7 показана кинетическая кривая ферментативной реакции, построенная по уравнению Михаэлиса-Ментен, представляющая собой гиперболическую зависимость стационарных скоростей катализируемой ферментом реакции от концентрации субстрата.

Для графического определения Км уравнение (5.12) может быть преобразовано следующим образом:

из которого следует линейная зависимость 1/v от 1/[S].

Подобное преобразование первыми предложили Г. Лайнуивер и Д. Бэрк, поэтому уравнение (5.13) и график (рис. 5.8) носят их имена. Тангенс угла наклона прямой на рис. 5.8 равен соотношению

Рис. 5.8. График Лайнуивера-Бэрка

Км /vmax, величина, отсекаемая на оси 1/v, соответствует значению

Если на графике (см. рис. 5.8) провести линию до пересечения с осью 1/[S], то в точке 1/v = О 1/[S] — •-1/*м-

Таким образом, при экспериментальном определении скорости процесса минимум при двух различных концентрациях субстрата можно получить константу Км.

Кинетика ферментативных реакций

Одним из характерных проявлений жизни является удивительная способность живых организмов кинетически регулировать химические реакции, подавляя стремление к достижению термодинамического равновесия. Ферментативная кинетика занимается исследованием закономерностей влияния химической природы реагирующих веществ (ферментов, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрация, рН среды, температуры, присутствие активаторов или ингибиторов) на скорость ферментативной реакции. Главной целью изучения кинетики ферментативных реакций является получение информации, которая может способствовать выяснению молекулярного механизма действия фермента.

Общие принципы кинетики химических реакций применимы и к ферментативным реакциям. Известно, что любая химическая реакция характеризуется константой термодинамического равновесия. Она выражает состояние химического равновесия, достигаемого системой, и обозначается Кр. Так, для реакции:

Рис. 4.12. Теоретический график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента.

а — реакция первого порядка (при [ S ]

Таким образом, константа равновесия равна отношению констант скоростей прямой и обратной реакций. Величину, обратную константе равновесия, принято называть субстратной константой, или, в случае ферментативной реакции, константой диссоциации фермент–субстратного комплекса, и обозначать символом KS. Так, в реакции

т.е. KSравна отношению произведения концентрации фермента и субстрата к концентрации фермент-субстратного комплекса или отношению констант скоростей обратной и прямой реакций. Следует отметить, что константа KSзависит от химической природы субстрата и фермента и определяет степень их сродства. Чем ниже значение KS, тем выше сродство фермента к субстрату.

При изучении кинетики ферментативных реакций следует учитывать одну важную особенность этих реакций (не свойственную обычным химическим реакциям), связанную с явлением насыщения фермента субстратом. При низкой концентрации субстрата зависимость скорости реакции от концентрации субстрата (рис. 4.12) является почти линейной и подчиняется кинетике первого порядка. Это означает, что скорость реакции S —> Р прямо пропорциональна концентрации субстрата S и в любой момент времени t определяется следующим кинетическим уравнением:

где [S] – молярная концентрация субстрата S; –d[S]/dt – скорость убыли субстрата; k’ – константа скорости реакции, которая в данном случае имеет размерность, обратную единице времени (мин –1 или с –1 ).

При высокой концентрации субстрата скорость реакции максимальна, становится постоянной и не зависящей от концентрации субстрата [ S ] . В этом случае реакция подчиняется кинетике нулевого порядка v = k» (при полном насыщении фермента субстратом) и целиком определяется концентрацией фермента. Различают, кроме того, реакции второго порядка, скорость которых пропорциональна произведению концентраций двух реагирующих веществ. В определенных условиях при нарушении пропорциональности говорят иногда о реакциях смешанного порядка (см. рис. 4.12).

Изучая явление насыщения, Л. Михаэлис и М. Ментен разработали общую теорию ферментативной кинетики. Они исходили из предположения, что ферментативный процесс протекает в виде следующей химической реакции:

т.е. фермент Е вступает во взаимодействие с субстратом S с образованием промежуточного комплекса ES, который далее распадается на свободный фермент и продукт реакции Р. Математическая обработка на основе закона действующих масс дала возможность вывести уравнение, названное в честь авторов уравнением Михаэлиса–Ментен, выражающее количественное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции:

Из уравнения Михаэлиса–Ментен следует, что при высокой концентрации субстрата и низком значении KSскорость реакции является максимальной, т.е. v = Vmax(реакция нулевого порядка, см. рис. 4.12). При низкой концентрации субстрата, напротив, скорость реакции оказывается пропорциональной концентрации субстрата в каждый данный момент (реакция первого порядка).

Следует указать, что уравнение Михаэлиса–Ментен в его классическом виде не учитывает влияние на скорость ферментативного процесса продуктов реакции, например в реакции

и носит несколько ограниченный характер. Поэтому были предприняты попытки усовершенствовать его. Так, было предложено уравнение Бриггса-Холдейна:

где Кm представляет собой константу Михаэлиса, являющуюся экспериментально определяемой величиной. Она может быть представлена следующим уравнением:

Рис. 4.13. Кривая уравнения Михаэли-са-Ментен: гиперболическая зависимость начальных скоростей катализируемой ферментом реакции от концентрации субстрата.

В числителе представлены константы скоростей распада комплекса ES в двух направлениях (в сторону исходных Е и S и в сторону конечных продуктов реакции Е и Р). Отношение k–1/ k+1представляет собой константу диссоциации ферментсубстратного комплекса KS, тогда:

Отсюда вытекает важное следствие: константа Михаэлиса всегда больше константы диссоциации фермент-субстратного комплекса KSна величину

Для определения численного значения Кm обычно находят ту концентрацию субстрата, при которой скорость ферментативной реакции v составляет половину от максимальной Vmax, т.е. если v = 1 /2 Vmaх. Подставляя значение v в уравнение Бриггса–Холдейна, получаем:

разделив обе части уравнения на Vmах, получим

Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость данной ферментативной реакции составляет половину от максимальной.

Определение величины Кm имеет важное значение при выяснении механизма действия эффекторов на активность ферментов и т.д. Константу Михаэлиса можно вычислить по графику (рис. 4.13). Отрезок на абсциссе, соответствующий скорости, равной половине максимальной, будет представлять собой Кm.

Пользоваться графиком, построенным в прямых координатах зависимости начальной скорости реакции v0 от начальной концентрации субстрата [S0], неудобно, поскольку максимальная скорость Vmaxявляется в данном случае асимптотической величиной и определяется недостаточно точно.

Рис. 4.14. График Лайнуивера-Бэрка.

Для более удобного графического представления экспериментальных данных Г. Лайнуивер и Д. Бэрк преобразовали уравнение Бриггса–Хол-дейна по методу двойных обратных величин исходя из того принципа, что если существует равенство между двумя какими-либо величинами, то и обратные величины также будут равны. В частности, если

то после преобразования получаем уравнение:

которое получило название уравнения Лайнуивера–Бэрка. Это уравнение прямой линии: у = ах + b. Если теперь в соответствии с этим уравнением построить график в координатах 1/v (y) от l/[S] (x), то получим прямую линию (рис. 4.14), тангенс угла наклона который будет равен величине Km/Vmax; отрезок, отсекаемый прямой от оси ординат, представляет собой l/Vmax(обратная величина максимальной скорости). Если продолжить прямую линию за ось ординат, тогда на абсциссе отсекается отрезок, соответствующий обратной величине константы Михаэлиса – 1/Кm (см. рис. 4.14). Таким образом, величину Кm можно вычислить из данных наклона прямой и длины отрезка, отсекаемого от оси ординат, или из длины отрезка, отсекаемого от оси абсцисс в области отрицательных значений.

Следует подчеркнуть, что значения Vmax, как и величину Кm, более точно, чем по графику, построенному в прямых координатах, можно определить по графику, построенному по методу двойных обратных величин. Поэтому данный метод нашел широкое применение в современной энзимологии. Предложены также аналогичные графические способы определения Кm и Vmaxв координатах зависимости v от v/[S] и [S]/v от [S].

Следует отметить некоторые ограничения применения уравнения Ми-хаэлиса–Ментен, обусловленные множественными формами ферментов и аллостерической природой фермента. В этом случае график зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата (кинетическая

Рис. 4.15. Сигмоидная кинетическая кривая насыщения субстратом.

кривая) имеет не гиперболическую форму, а сигмоидный характер (рис. 4.15) наподобие кривой насыщения гемоглобина кислородом. Это означает, что связывание одной молекулы субстрата в одном каталитическом центре повышает связывание субстрата с другим центром, т.е. имеет место кооперативное взаимодействие, как и в случае присоединения кислорода к 4 субъединицам гемоглобина. Для оценки концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной, в условиях сигмоидного характера кинетической кривой обычно применяют преобразованное уравнение Хилла:

где К’ – константа ассоциации; n – число субстратсвязывающих центров.


источники:

http://studme.org/167632/geografiya/zavisimost_skorosti_fermentativnyh_reaktsiy_kontsentratsii_substrata_sredy_temperatury_uravnenie_mihae

http://xumuk.ru/biologhim/049.html